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ＤＮＡクローニング、または組換えＤＮＡ技術は、目的の遺伝子（標的遺伝子）が単離され、プラスミド細菌などの自己複製生物に移される分子生物学的ツールである。細菌プラスミドの遺伝暗号は、科学的目的のために操作され分析されるのに十分な量で所望の遺伝子の複数のコピーを複製しそして生成するであろう。遺伝子クローニングは、標的遺伝子の末端でDNAを切断するプラスミドおよび制限酵素を使用することによって、あるいは「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）と呼ばれるテストを実行することによっても達成できます。所望の遺伝子を増幅するポリメラーゼ連鎖反応。
説明書
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PCR技術とクローニングプロトコルをよく理解してください。クローニングに成功したいのであれば、分子生物学に関する科学的環境ではすでに知っておくべき、理解する必要がある多くの情報があります。多くのプロトコルおよびクローニングキットは、Qiagen、Invitrogen、Promega、Applied Biosystemsなどの会社から市販されている。したがって、クローン作成に必要なものを決定し、適切な資料とリソースを選択してください。
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目的の遺伝子に対してPCR反応を行います。 ＰＣＲプロセスは、二本鎖ＤＮＡを変性させるための加熱および冷却サイクル、目的の遺伝子の末端を標識するためのプライマーと呼ばれる小さなＤＮＡフラグメントのハイブリダイゼーション（またはアニーリング）および新しい相補鎖の構築を含む。 DNAポリメラーゼと呼ばれる酵素を用いたDNAの合成これらの工程は40〜50回繰り返され、各サイクルからそれらのDNAを増幅し、数千コピーの標的遺伝子をもたらす。適切なプライマーを使用して、イニシエーターと増幅したいコードの目的の領域との間にランダムなリンクが存在するように、遺伝子配列を知る必要があります。クローニング方法によっては、例えば特定の遺伝子の最終化（平滑末端）やTAクローニング（切断を容易にするために設計された相補的チミンとのリンクが含まれる）の突然の切断など、特定のDNAポリメラーゼ酵素が必要になる場合があります。例えば、Taqポリメラーゼ、高温で合理的に熱安定性であるがヌクレオチド修正能力を有さないポリメラーゼ、それ故、新しいDNA鎖の構築を通して、TaqはDNAを順次増幅しそして凝集性を残すであろう。増幅。
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所望ならば、増幅された遺伝子はＰＣＲにおいて精製されなければならない。このステップはいくつかの方法で実行できます。考えられる1つの方法は、回転しているカラムでろ過して、残っているプライマーや酵素を除去することです。あるいは、電気泳動を行って、得られたＤＮＡバンドを分離し、切断しそして洗浄することができる。
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精製した遺伝子をつなぎ、適切なPCRプラスミドベクターによって増幅する。市販のキットでは、pGEMまたはpCR2.1などの標準的なプラスミドベクターが提供されます。製造元のキットまたは増幅DNA、結合バッファー、プラスミド、およびDNAリガーゼ酵素の必要量に関する推奨に従って、結合反応を設定します。結合反応は環状プラスミドがその遺伝子をプラスミドゲノムに導入することを可能にするであろう。
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プラスミドベクター（その遺伝子を含む）が細菌細胞に挿入される形質転換反応を行う。しばしば大腸菌を用いる。このステップの準備の数日前に寒天プレートを作り、インキュベーターにプレートを保管してください。試薬量を追加し、使用しているプロトコルに記載されているインキュベーション時間を使用して、プラスミドと細胞を非常に慎重に組み合わせます。寒天プレート上にあなたの細菌細胞を広げ、37度でインキュベートし、それらを一晩放置する。
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寒天プレート上で青と白の細菌のコロニーをメモしてください。挿入遺伝子を含むコロニーは青ではなく白になります。いくつかの白いコロニーを選択し、それらのクローン化された遺伝子インサートを有する大量の細菌を得るために、アンピシリンを含む溶原性ブロス（LB）を含む培地中でそれらを培養する。このステップの後、あなたはあなたの増幅されコードされた遺伝子の素晴らしいオファーを持つでしょう。クローニングした遺伝子のスクリーニングを行うには、市販のキットを使用して細菌プラスミドDNAを単離し、その遺伝子を精製します。必要になるまで冷凍庫に保管してください。
必要なもの
- 市販のクローニングキット
- PCR試薬
- サーモサイクラー（またはPCR機/ PCR機）
- インキュベーター
- 実験装置および供給
- クローニング対象遺伝子
